Detecção de glúten por qPCR: uma alternativa para rastreamento em alimentos processados

Abstract

Este trabalho relata um ensaio de PCR em tempo real para detectar especificamente a presença de glúten em matrizes alimentares complexas, bem como realizar uma prospecção, in sílico, de primers utilizados em pesquisas científicas. Os testes in sílico foram realizados utilizando dois softwares, MFE e NETprimer, e os parâmetros de conteúdos GC, Tm (°C), ∆G (kcal/mol), formação de dímero e grampos, bem como a sua classificação também foram avaliados. O primer “Wheat-w-Gliadin” apresentou os melhores parâmetros médios: tamanho= 24 pb; GC= 44%; Tm= 62,5 °C; ∆G= -32,25 kcal/mol; sem formação de dímeros ou grampos; e uma classificação máxima do primer (100). Houve diferenças de resultados entre os softwares utilizados. Os primers utilizados foram “WF1-WR1”, “tritprglut” e “Planta 18S” (gene referência), que tiveram valores médios de ciclo de quantificação (Cq) de 17.43, 34.30 e 16.98, respectivamente. O protocolo da PCR em tempo real foi validado em diferentes carnes (bovino, frango, suíno, cavalo e ovino) com um Cq médio de 25,69. A aplicabilidade do ensaio ainda foi aplicada por meio de análises com produtos alimentícios obtidos em ambientes comerciais, sendo: barra de cereal, chocolate, biscoito água e sal, e dois tipos de snacks. Todos os alimentos estavam em conformidade com as informações contidas no rótulo, exceto a barra de cereal que estava identificada como “pode conter glúten” e apresentou uma concentração de “alto teor” (1.925 mg/kg). O valor de LD foi de 36 ciclos e LQ de 60 mg/kg, estando dentro da faixa de classificação de “baixo teor”. Para finalizar, foram testados dois tipos de fluorogênico SYBR® Green e Eva Green, sendo o primeiro mais eficiente para a análise de detecção do glúten. Eva Green apresentou uma fluorescência muito elevada não sendo possível determinar os valores de Cq do DNA na curva padrão e nas amostras. Os resultados destacam a potencialidade da técnica de PCR em tempo real na detecção de glúten e/ou alergênicos em alimentos com matriz complexa, como chocolate e barra de cereal testadas neste estudo, se mostrando sensível e robusta para detectar a presença de concentrações de glúten potencialmente nocivas para consumidores celíacos.