Detecção de espécies animais utilizando PCR em tempo real (qPCR) para verificar fraudes em produtos cárneos processados

Abstract

A rotulagem de alimentos é fundamental para evitar a ingestão de uma espécie de carne específica por motivos religiosos e razões culturais, mas, principalmente, para evitar fraudes com o propósito de obter vantagens financeiras. O método real-time qPCR é comumente utilizado para quantificar o DNA em uma determinada amostra através da quantificação relativa, usando Cq comparativo (concentração do DNA alvo específico sobre a concentração do DNA endógeno). Em estudos que usam a qPCR para quantificar espécies contaminantes, a normalização é realizada usando um gene de referência de cópia única, como a miostatina, presente na maioria dos mamíferos e das aves. Esse estudo teve por objetivo avaliar se o sistema primer-sonda espécie-específica detecta individualmente cada espécie animal (bovino, suíno, frango, ovino e equídeo), empregando a sonda TaqMan® e o sistema primer espécie-específica com o corante SYBR® Green; e padronizar a técnica real-time qPCR para a obtenção de resultados quantitativos relativos em carnes bovinas fraudadas. Os resultados do estudo revelaram que os sistemas primer-sondas são específicos e amplificaram corretamente os respectivos DNAs de cada espécie animal, mesmo quando foram combinados em um único microtubo. O gene de referência (miostatina) para verificar a amplificabilidade do ácido nucleico, usado como controle positivo, também co-amplificou na PCR, indicando a exclusão de resultados falso-negativos. Para a padronização do método, o limite de detecção (LD) resultou em um sinal de fluorescência Cq de 36.80 ciclos em pelo menos 9 de 10 repetições (90%) na concentração de 0,008% em cavalo e Cq de 36.60 ciclos em pelo menos 7 de 10 repetições (70%) na concentração de 0,0005% em frango. A concentração mais baixa (LQ) em que o desvio padrão relativo (RSD) foi ≤25% estava entre 0,125% (RSD 19,4%) e 0,031% (RSD 25,6%) para cavalo e entre 0,125% (RSD 6,13%) e 0,031% (RSD 26,94%) para frango. Observou-se que as informações contidas nos rótulos de sete produtos cárneos processados foram 100% coerentes com o rótulo do fabricante. Ambos os mastermix para sonda e para SYBR® Green apresentaram resultados concordantes, visto que o ideal para o corante é reduzir o número de ciclos para evitar resultados falso-positivos ou acúmulo de sinal fluorescente nos ciclos finais da PCR. Mesmo usando curvas padrões de quantificação contendo 50% de misturas de carnes ou 100% de carne pura do alvo, a inclinação da curva, a eficiência de amplificação e a correlação linear estiveram dentro do critério de aceitação recomendado. O ensaio proposto esteve de acordo com os critérios mínimos definidos para a quantificação, sendo um método sensível e uma alternativa na rotina de fiscalização de produtos tanto para alimentação humana quanto animal.