Resumo:
A rotulagem de alimentos é fundamental para evitar a ingestão de uma espécie de carne
específica por motivos religiosos e razões culturais, mas, principalmente, para evitar fraudes
com o propósito de obter vantagens financeiras. O método real-time qPCR é comumente
utilizado para quantificar o DNA em uma determinada amostra através da quantificação
relativa, usando Cq comparativo (concentração do DNA alvo específico sobre a concentração
do DNA endógeno). Em estudos que usam a qPCR para quantificar espécies contaminantes, a
normalização é realizada usando um gene de referência de cópia única, como a miostatina,
presente na maioria dos mamíferos e das aves. Esse estudo teve por objetivo avaliar se o sistema
primer-sonda espécie-específica detecta individualmente cada espécie animal (bovino, suíno,
frango, ovino e equídeo), empregando a sonda TaqMan® e o sistema primer espécie-específica
com o corante SYBR® Green; e padronizar a técnica real-time qPCR para a obtenção de
resultados quantitativos relativos em carnes bovinas fraudadas. Os resultados do estudo
revelaram que os sistemas primer-sondas são específicos e amplificaram corretamente os
respectivos DNAs de cada espécie animal, mesmo quando foram combinados em um único
microtubo. O gene de referência (miostatina) para verificar a amplificabilidade do ácido
nucleico, usado como controle positivo, também co-amplificou na PCR, indicando a exclusão
de resultados falso-negativos. Para a padronização do método, o limite de detecção (LD)
resultou em um sinal de fluorescência Cq de 36.80 ciclos em pelo menos 9 de 10 repetições
(90%) na concentração de 0,008% em cavalo e Cq de 36.60 ciclos em pelo menos 7 de 10
repetições (70%) na concentração de 0,0005% em frango. A concentração mais baixa (LQ) em
que o desvio padrão relativo (RSD) foi ≤25% estava entre 0,125% (RSD 19,4%) e 0,031%
(RSD 25,6%) para cavalo e entre 0,125% (RSD 6,13%) e 0,031% (RSD 26,94%) para frango.
Observou-se que as informações contidas nos rótulos de sete produtos cárneos processados
foram 100% coerentes com o rótulo do fabricante. Ambos os mastermix para sonda e para
SYBR® Green apresentaram resultados concordantes, visto que o ideal para o corante é reduzir
o número de ciclos para evitar resultados falso-positivos ou acúmulo de sinal fluorescente nos
ciclos finais da PCR. Mesmo usando curvas padrões de quantificação contendo 50% de misturas
de carnes ou 100% de carne pura do alvo, a inclinação da curva, a eficiência de amplificação e
a correlação linear estiveram dentro do critério de aceitação recomendado. O ensaio proposto
esteve de acordo com os critérios mínimos definidos para a quantificação, sendo um método
sensível e uma alternativa na rotina de fiscalização de produtos tanto para alimentação humana
quanto animal.
