A utilização da erva-mate como base de chá para a produção de kombucha é uma importante alternativa para valorizar uma planta tradicional da América do Sul. O presente trabalho teve como objetivo avaliar as características da kombucha de erva-mate durante a fermentação, monitorando as mudanças de pH, acidez, polifenóis, etanol, ácido acético, perfil sensorial e aceitação até 7 dias de fermentação a 25ºC e 30ºC. Além disso, foram identificadas culturas simbióticas da microbiota ativa de bactérias e leveduras (SCOBY) no início e no final do bioprocesso. As kombuchas de erva-mate fermentadas a 25ºC por 5 dias ou 30ºC por 4 dias foram aptas para consumo de acordo com as normas brasileiras. Os teores de ácido acético, etanol e clorofila foram dependentes do tempo e da temperatura de fermentação, ao contrário do teor de fenólicos totais. As principais leveduras e bactérias no SCOBY foram Brettanomyces bruxellensis e Komagataeibacter rhaeticus, respectivamente, que permaneceram dominantes quando a fermentação foi conduzida por até 7 dias a 25ºC ou 30ºC. A fermentação da infusão de erva-mate levou a produtos caracterizados por acidez, amargor de vinagre e sabores/aromas fermentados, tornando a aceitação da kombucha de erva-mate não fermentada maior do que infusões fermentadas. Assim, o tempo e as condições de fermentação durante a produção da kombucha de erva-mate devem ser controlados, pois podem afetar negativamente o perfil sensorial e a aceitação da bebida.